【琼脂糖电泳步骤】在分子生物学实验中，琼脂糖凝胶电泳是一种常见且基础的实验技术，主要用于分离和分析DNA或RNA片段。该方法操作简便、成本较低，广泛应用于基因检测、PCR产物分析、质粒鉴定等领域。下面将详细介绍琼脂糖凝胶电泳的基本步骤与注意事项。

一、实验准备

1. 材料准备

- 琼脂糖粉末

- 电泳缓冲液（如TAE或TBE）

- 紫外透射仪（用于观察结果）

- 电泳槽、梳子、微量移液器及枪头

- DNA Marker（作为分子量标准）

- 染色剂（如溴化乙锭EB或安全染料）

2. 仪器检查

在开始实验前，确保电泳槽、电源、紫外灯等设备处于正常工作状态，并准备好所需的耗材。

二、制备琼脂糖凝胶

1. 称量琼脂糖

根据目标DNA片段大小选择合适的浓度。通常，0.8%～1.5%的琼脂糖适用于大多数DNA片段的分离。例如，1%的琼脂糖适用于约500 bp至10 kb的DNA。

2. 溶解琼脂糖

将称好的琼脂糖加入适量的电泳缓冲液中，加热至沸腾直至完全溶解。注意：避免过热导致溶液蒸发过多。

3. 冷却与倒入模具

将溶液稍作冷却后，倒入已放置好梳子的凝胶模具中。等待其自然凝固（一般需15-30分钟）。

三、加样与电泳

1. 样品处理

在待测DNA样本中加入适量的上样缓冲液（如6× Loading Buffer），以增加密度并便于观察迁移情况。

2. 加样

使用微量移液器将样品和DNA Marker分别加入凝胶孔中。注意避免气泡产生，以免影响电泳效果。

3. 通电运行

将凝胶放入电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液，使凝胶完全浸没。接通电源，设置电压为80-120 V，根据所需时间进行电泳（一般30-60分钟）。

四、显影与分析

1. 染色

电泳结束后，取出凝胶，放入染色液中浸泡一定时间（约15-30分钟）。若使用EB，则需在紫外灯下观察；若使用安全染料，可直接在可见光下观察。

2. 成像记录

将凝胶置于紫外透射仪或成像系统中，拍摄图像并保存。通过对比DNA Marker的条带位置，判断目标片段的大小与纯度。

五、注意事项

- 实验过程中应佩戴手套与护目镜，避免接触有害物质。

- 电泳时注意电压不要过高，防止DNA片段扩散。

- 凝胶制备后应尽快使用，避免长时间存放导致结构变化。

通过以上步骤，可以完成一次完整的琼脂糖凝胶电泳实验。掌握这一基础技术，是进行后续分子生物学研究的重要前提。